Horticulture Res| 西南大学通过亚细胞定位等技术揭示CsWAKL08通过调控ROS和JA信号传导的机制正向调节柑橘CBC抗性

Horticulture Res| 西南大学通过亚细胞定位等技术揭示CsWAKL08通过调控ROSJA信号传导的机制正向调节柑橘CBC抗性

西南大学中国农业科学院柑橘研究所的研究人员于Horticulture Research上发表了一篇题为“CsWAKL08, a pathogen-induced wall-associated receptor-like kinase in sweet orange, confers resistance to citrus bacterial canker via ROS control and JA signaling”的研究文献,该文献揭示了一种病原体诱导的柑橘中与壁相关的受体样激酶CsWAKL08,通过ROS控制和JA信号转导赋予柑橘溃疡病抗性。

文章来源

背景

柑橘溃疡病(CBC)对柑橘生产构成了严重威胁。WAKL是在抵抗多种真菌和细菌性疾病中起主要作用的蛋白质。然而,尚不清楚WAKL在抵抗CBC中的作用。在此研究了赋予CBC抗性的CsWAKL08的作用,并分析了CsWAKL08介导的CBC抗性的分子机制。研究发现植物激素水杨酸(SA)和甲基茉莉酸(MeJA)也可以诱导CsWAKL08,并跨越质膜。与对照植物相比,过表达CsWAKL08的植物中的过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著增强,从而在转基因植物中介导了活性氧(ROS)稳态。


结果

柑橘中CsWAKL的鉴定和生物信息学分析

使用MEGA V7.2构建了21CsWAKL的系统发育树,每个CsWAKL具有N末端GUB-WAK结构域和C末端激酶结构域,在这21个完整的CsWAKL中检测到15个保守的基序。


CsWAKL08是可能受Xcc影响的CBC抗性基因

研究了这21CsWAKL的表达,为了确定CsWAKLCBC之间的关系,通过qRT-PCRCBC敏感品种和抗CBC的品种之间测定了感染后CsWAKL的表达。结果发现在抗性品种中,CsWAKL01CsWAKL08表达连续上调。而敏感品种中表达没有明显变化,因此这两个CsWAKL基因可以代表Xcc抗性基因。而CsWAKL20表现出与之相反的表达谱,因此该基因可能与Xcc敏感性有关。1. CsWAKL家族的全基因组注释和Xcc诱导的表达谱


CsWAKL08编码WAKL

使用从敏感品种叶片样品中分离的RNA获得了CsWAKL08的完整转录序列。CsWAKL08是由位于C. sinensis 9号染色体上的基因编码的715个残基的WAKLORF可能编码功能蛋白。其包含一个短内含子和一个1358 bp的内含子,C端结构域包含Ser/Thr激酶结构域,为激酶活性的中心。该蛋白还包含一个预测跨膜(TM)结构,介于 aa 312- 335之间,由外显子23编码。


CsWAKL08SAMeJA诱导

植物激素通常调节植物疾病相关的蛋白质的表达,为了研究CsWAKL08在抗病相关信号中的作用,对两个品种植株进行了ABAMeJASA处理,并通过qRT-PCR分析了CsWAKL08的表达。结果表明,在抗CBC的植种中,MeJASA均可诱导CsWAKL08的表达,而在敏感株中,CsWAKL08的表达程度较低。这些发现表明CsWAKL08在一些与疾病抗性相关的信号传导途径中起作用。

CsWAKL08的生物信息学和表达特征

2. CsWAKL08的生物信息学和表达特征


CsWAKL08定位于质膜

CsWAKL08亚细胞定位进行了分析,在瞬时表达重组pLGNe-CsWAKL08-GFP质粒中研究CsWAKL08在细胞内的定位。结果CsWAKL08-GFP在质膜中非常明显,因此,预测分析和瞬时表达都清楚地表明CsWAKL08是一种细胞膜定位蛋白,可以在细胞外信号接收中发挥作用。

CsWAKL08定位于质膜

3. CsWAKL08定位于质膜


CsWAKL08的过表达赋予CBC

使用过表达CsWAKL08的转基因柑橘构建体进一步阐明CsWAKL08的作用,并进一步研究其在Xcc抗性中的作用。构建了由CaMV 35S启动子驱动的GUS编码序列的CsWAKL08过表达载体。通过PCR在三株转基因植物(OE1-OE3)中检测到一个片段,该片段在用空载体转化的对照植物(CK)中不存在,并且在叶圆片边缘上有明显的蓝色GUS染色。qRT-PCR进一步证实这三种过表达植物表达高水平的CsWAKL08。为了研究这些转基因植物的CBC抗性,进行了下一步研究。通过渗透法进一步评估了转基因植物的抗性。结果表明,CsWAKL08的过表达可以强烈增强转基因柑橘中对Xcc的抗性。

CsWAKL08过表达植物中Xcc反应的评估

4. CsWAKL08过表达植物中Xcc反应的评估


CsWAKL08沉默赋予CBC敏感性

为了进一步评估CsWAKL08在敏感型植株中的重要性,通过RNA干扰敲低了CsWAKL08。为了验证所得的转基因植物,进行了PCR,通过GUS染色对这五株植物进行验证。qRT-PCR证实这五株植物表现出相对较低的CsWAKL08表达。数据表明柑橘中CsWAKL08的沉默增加了对Xcc的敏感性。CsWAKL08突变体表现出CBC敏感性增强,这表明CsWAKL08对于CBC抗性很重要。

CsWAKL08沉默的植物中Xcc反应的评估

5. CsWAKL08沉默的植物中Xcc反应的评估


CsWAKL08参与抗氧化剂系统以重建ROS稳态作为Xcc感染的防御反应

植物抗性反应常常取决于ROS诱导的对病原体或植物细胞凋亡性的氧化损伤。为了确定ROS稳态是否参与CsWAKL08介导的Xcc抗性,分析了CK和转基因植物中的相对ROS水平。结果发现在具有Xcc抗性的植株中,H2O2水平高于CK植物中的水平,而O2-较低。高水平的H2O2可能在Xcc感染过程中引起超敏反应。在Xcc敏感性的植株中,ROS浓度与过表达植物的ROS浓度相反。这些结果证实了ROS水平与Xcc耐药性之间潜在联系。

植物具有抗氧化酶,包括过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD。由于ROS是可诱导并受CsWAKL08严格调控,因此研究了抗氧化酶的表达。发现PODSOD活性均被CsWAKL08过表达上调,并被CsWAKL08沉默抑制。因此过表达CsWAKL08的细胞抗性水平的提高与活性更高的酶系统控制的ROS稳态存在联系。

CsWAKL08调节转基因植物中的ROS稳态

6. CsWAKL08调节转基因植物中的ROS稳态


CsWAKL08积极调节JA积累

植物激素包括SAJA,在免疫信号网络中发挥关键作用。研究了转基因植物和CK植物中SAJA的含量。此外,分别研究了参与JASA的生物合成的CsAOSCsICS基因的转录水平。与CK相比,转基因植物的JA含量显著较高,在Xcc感染后显著上调,CsWAKL08的过表达或沉默均未显著诱导SA含量。结果表明CsWAKL08可能通过调节JA的生物合成在JA的积累中起作用。

CsWAKL08积极调节转基因植物中的JA生物合成

7.CsWAKL08积极调节转基因植物中的JA生物合成


CsWAKL08调节对Xcc感染的JA依赖性信号传导

CsWAKL08可能通过调控JA依赖性信号传导来调控Xcc感染。为了验证研究了这些转基因植物中某些JA反应基因的表达。LOX1MPK3是在植物抗性中有作用,已被证实参与JA依赖性信号PR蛋白。结果表明,CsLOX1分别在CsWAKL08过表达和沉默植物中上调和下调,而CsMPK3类似。结果表明CsWAKL08在抗性中起作用,证实了CsWAKL08可以通过调节JA依赖性信号激活JA响应来调节Xcc感染,从而赋予CBC抗性和耐受性。

CsWAKL08积极调节转基因植物中JA反应基因的表达

8. CsWAKL08积极调节转基因植物中JA反应基因的表达


结论

根据研究结果得出结论,CsWAKL08通过调控ROSJA信号传导的机制正向调节CBC抵抗力。这些结果进一步突出了该激酶家族在植物病原体抗性中的重要性。

该研究受到国家重点基础研发计划,中央高校基本科研基金,广西科技重点项目和国家现代农业产业技术体系建设项目的支持。

参考文献

1Krattinger, S. G. & Keller, B. Molecular genetics and evolution of disease

resistance in cereals. N. Phytol. 212, 320–332 (2016).

2Yang, P. et al. Fungal resistance mediated by maize wall-associated kinase

ZmWAK-RLK1 correlates with reduced benzoxazinoid content. N. Phytol. 221,

976–987 (2019).

3Hurni, S. et al. The maize disease resistance gene Htn1 against northern corn

leaf blight encodes a wall-associated receptor-like kinase. Proc. Natl Acad. Sci.

USA 112, 8780–8785 (2015).

文献链接

https://doi.org/10.1038/s41438-020-0263-y

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柑橘溃疡病(CBC)对柑橘生产构成了严重威胁。WAKL是在抵抗多种真菌和细菌性疾病中起主要作用的蛋白质。然而,尚不清楚WAKL在抵抗CBC中的作用。在此研究了赋予CBC抗性的CsWAKL08的作用,并分析了CsWAKL08介导的CBC抗性的分子机制。研究发现植物激素水杨酸(SA)和甲基茉莉酸(MeJA)也可以诱导CsWAKL08,并跨越质膜。与对照植物相比,过表达CsWAKL08的植物中的过氧化物
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