OXID MED CELL LONGEV|成都中医药大学通过western blotting等方法揭示HAS通过调节PI3K/Akt信号通路来抑制氧化应激诱导的细胞凋亡并对H₂O₂刺激的PC12细胞具有保护作用

成都中医药大学药学院的研究人员于OXID MED CELL LONGEV上发表了一篇题为“Hydroxy-α-sanshool Possesses Protective Potentials on H₂O₂-Stimulated PC12 Cells by Suppression of Oxidative Stress-Induced Apoptosis through Regulation of PI3K/Akt Signal Pathway”的研究文献，该文献通过western blotting等方法揭示了HAS通过增强SOD等酶活性，调节PI3K/Akt信号通路抑制氧化应激诱导的细胞凋亡，对H₂O₂刺激的PC12细胞具有保护作用。

背景

花椒果皮作为中药常用于消炎和镇痛，而HAS是花椒果皮最重要的活性成分。在此通过H₂O₂诱导的PC12细胞模型研究了HAS的神经保护作用及其相关的可能机制。CCK-8分析结果表明，HAS对H₂O₂具有保护作用。丙二醛（MDA），超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定的结果表明，HAS可以增加SOD，CAT和GSH-Px的酶活性。此外，western blotting分析显示，HAS可以上调PC12 中p-PI3k，Akt，p-Akt和Bcl-2的表达，而下调caspase-3和Bax的表达。

结果

HAS保护H₂O₂诱导的PC12细胞的细胞活力

研究表明，7.5-120 μM的浓度范围内的HAS，对 PC12细胞的活性没有明显影响。CCK-8测定结果显示，90 μM H₂O₂处理能显著降低PC12细胞的活性，用 HAS预处理2小时可显著提高H₂O₂诱导的PC12细胞的细胞活性。

图1.HAS对H2O2诱导的PC12细胞活力的保护作用

HAS抑制H₂O₂诱导的PC12细胞凋亡

通过DAPI染色法和Annexin V-FITC/PI双染细胞凋零检测法研究了PC12细胞的凋亡，采用DAPI染DNA来研究H₂O₂诱导的PC12细胞的核形态变化。H₂O₂刺激后在细胞核中可以明显观察到核的收缩和亮度增加，表现出典型的凋亡特征。不同浓度的HAS处理显著减弱了H₂O₂诱导PC12细胞的凋亡。

图2.HAS对H2O2刺激的PC12细胞凋亡的影响

此外，还使用JC-1探针检测了H₂O₂对的PC12细胞的损伤。结果表明，HAS可以显著抑制H₂O₂刺激的PC12细胞凋亡。

图3.HAS对PC12细胞的影响

HAS减少了PC12细胞中H₂O₂刺激的ROS生成

为了研究HAS对H₂O₂诱导的PC12细胞抗凋亡作用的可能机制，确定了PC12细胞中的ROS生成。使用荧光探针DCFH-DA来进一步研究HAS是否可以抑制H₂O₂刺激的ROS的产生及相关的氧化应激。结果发现用 H₂O₂处理时，细胞中产生的ROS急剧增加，而HAS显著降低了细胞内ROS积累。

图4.HAS对H2O2刺激的PC12细胞的ROS水平的影响

HAS增强H₂O₂刺激的PC12细胞中ROS清除酶的活性

细胞内MDA，SOD，GSH-Px和CAT是评价细胞或组织氧化应激水平的常用指标。为了阐明HAS是否通过抗氧化剂作用保护PC12细胞免受H₂O₂诱导的损害，研究了HAS对H₂O₂刺激的PC12细胞中ROS清除酶（SOD，GSH-Px和CAT）活性的影响。在 H₂O₂ 处理的PC12细胞中，MDA显著增加，然而这种增长趋势在很大程度上受到HAS的抑制。另一方面，在H₂O₂刺激的PC12细胞中，包括SOD，GSH-Px和CAT在内的抗氧化酶的数量急剧减少，将细胞用HAS处理可以将三种酶的含量提高。以上结果表明，HAS处理可能通过增强ROS清除酶的活性来保护PC12细胞免受H₂O₂引起的损伤。

图5.HAS对H2O2刺激的PC12细胞中SOD，GSH-Px，MDA和CAT的影响

HAS调节H₂O₂刺激的PC12细胞中Caspase-3，Bax和Bcl-2的表达

为了探索HAS对H₂O₂刺激的PC12细胞抗凋亡作用的分子机制，进行了western blotting实验以检测细胞中caspase-3，Bax和Bcl-2的表达。H₂O₂刺激显著下调了PC12细胞中Bcl-2的抗凋亡蛋白的表达，同时上调Bax和casepase-3的凋亡蛋白表达，而HAS可逆转上述变化。

图6. HAS对H2O2刺激的PC12细胞中Caspase-3，Bax和Bcl-2的表达的影响

HAS调节H₂O₂刺激的PC12细胞中PI3K,p-PI3K,Akt和p-Akt的表达

进一步研究结果发现，用H₂O₂处理后，PC12细胞中Akt，p-Akt和p-PI3K的表达显著降低。而用HAS预处理显著上调PC12细胞的p Akt和P-PI3K的表达。此外，用HAS预处理还可以显著上调H₂O₂刺激的PC12细胞中的Akt的表达。这些结果表明，HAS可能通过调控PI3K/Akt途径对H₂O₂刺激的PC12细胞具有保护作用。

图7. HAS对H2O2刺激的PC12细胞中PI3K,p-PI3K,Akt和p-Akt的表达的影响

为了进一步探讨PI3K/Akt通路是否是HAS保护作用的关键，使用了化学抑制剂LY294002来抑制PI3K/Akt信号通路的表达。综合结果数据表明，HAS 通过对PI3K/Akt途径的调控对H₂O₂刺激的PC12细胞有保护作用。

图8. PI3K抑制剂LY294002对PC12细胞活力的影响

结论

研究表明，通过调节PI3K/Akt信号通路抑制氧化应激诱导的细胞凋亡，HAS对H₂O₂刺激的PC12细胞具有保护作用。我们的结果为在开发新的治疗与氧化应激诱导的过度凋亡相关的神经退行性疾病的药物时使用HAS提供了科学证据。

该研究受到四川省中医药管理局科技项目和成都中医药大学“杏林学者”学科人才科研提升计划的支持。

参考文献

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文献链接

https://doi.org/10.1155/2020/3481758

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