Genome Research|东北林业大学利用SGA开发出一种具有高发现率和快速酵母单杂交系统

Genome Research|东北林业大学利用SGA开发出一种具有高发现率和快速酵母单杂交系统

东北林业大学的研究人员于Genome Research上发表了一篇题为“A novel synthetic-genetic-array–based yeast one-hybrid system for high discovery rate and short processing time”的研究文献,该文献讲述利用SGA开发出一种具有高发现率和快速的酵母单杂交系统。


背景

原核和真核生物的生长和发育受转录调控基因表达的调控,在已知的用于检测TF-DNA相互作用的所有方法中,Y1H由于其便捷且低成本的特性仍然是最受欢迎的选择之一。在酵母遗传学中,已开发出合成遗传阵列(SGA)分析来鉴定两个基因或遗传性状的正相关性。在这项研究中,利用SGA系统进行Y1H筛选,发现了一种高通量减数分裂导向的酵母单杂交系统。


结果

用Magic Markers构建Y1H菌株

为了开发这种减数分裂定向Y1H系统,我们首先利用Magic Markers构造了一个适合于这项研究的Y1H菌株,并将最终菌株命名为Y1HGold- MM

酵母菌株的构建

图1.Y1H gold-mm 菌株的构造

 

Y1H的TF猎物和DNA诱饵的选择与构建

进行了转录组学分析,以鉴定在木材形成的组织和细胞中特异性或高度表达的TF。通过对木本植物Populus组织进行RNA-seq分析,鉴定了茎分化木质部(SDX)特异性TF。在细胞类型水平上,使用激光捕获显微切割技术从SDX中分离出两种类型的细胞进行RNA序列分析,从而鉴定出20种纤维特异性TF和37种血管特异性TF。选择了7个基因的2-kb启动子区作为DNA诱饵,然后将TF和DNA分别克隆到pGADT7和pAbAi载体中,用于Y1H筛选。

激光捕获技术采集不同类型的细胞

图2. 激光捕获显微切割技术采集不同类型细胞

减数分裂导向的Y1H系统

我们将含TF-猎物的质粒分别引入Y1HGold- MM菌株。并通过进一步的实验操作,得到可以选择具有特定杂交类型的单倍体形式的TF-DNA互作的酵母。新的Y1H系统将结合二倍体处理时间短的优势和单倍体转化提高TF-DNA相互作用的发现率的优势。

三种酵母单杂系统

图3. 三种Y1H系统

 

减数分裂导向的Y1H与两个传统Y1H系统的比较

然后,我们测试了该减数分裂导向的Y1H系统在7个DNA诱饵和92个TF猎物之间的相互作用,并将其与两种最常用的Y1H方法(二倍体交配和单倍体转化系统)进行了比较。对比分析表明,在三个Y1H系统中,减数分裂导向的筛选确定了最大数量的TF-DNA相互作用,并且可高度重现,减数分裂导向的Y1H可能会发现传统Y1H系统未发现的新型相互作用。

酵母单杂实验验证

图4. 通过三个Y1H系统获得的实验数据比较及验证

再现性实验

图5.减数分裂和二倍体交配系统的再现性试验

 

TF-DNA相互作用的验证

下来,我们使用染色质免疫沉淀(ChIP)分析Y1H鉴定TF-DNA的相互作用,以确定假阳性并验证相互作用的真实性和生物学相关性。以SD-X原生质体中TF-GFP融合的形式分别过表达鉴定出的TF,结果均表明,减数分裂导向的Y1H的ChIP富集度明显高于二倍体交配的Y1H,在这项研究中发现的九个经过ChIP验证的TF-DNA相互作用代表了三个木质素生物合成基因直接结合六个TF。

相互作用验证

图6.TF-DNA相互作用的验证

CHIP-qPCR验证

图7.ChIP-qPCR验证

 

结论

尽管Y1H筛选是公认的研究基因表达调控的有效方法,但是将其应用于基因组或大规模分析仍然是一项艰巨的任务,其中涉及数以万计的相互作用。对于这样情况,加工时间、技术稳定性和输出精度必须同时得到满足。我们研究的减数分裂导向系统将是更全面地了解植物和其他生物复杂生物过程中基因转调控的一种方法。

该研究受到国家自然科学基金会的资助。

参考文献

【1】     Brachmann CB, Davies A, Cost GJ, Caputo E, Li J, Hieter P, Boeke JD. 1998. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast 14: 115–132. doi:10.1002/(SICI)1097-0061 (19980130)14:23.0.CO;2-2

【2】     Chan YF, Marks ME, Jones FC, Villarreal G Jr, Shapiro MD, Brady SD, Southwick AM, Absher DM, Grimwood J, Schmutz J, et al. 2010. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science 327: 302–305. doi:10.1126/science .1182213

【3】     Deplancke B, Mukhopadhyay A, Ao W, Elewa AM, Grove CA, Martinez NJ, Sequerra R, Doucette-Stamm L, Reece-Hoyes JS, Hope IA, et al. 2006a. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell 125: 1193–1205. doi:10.1016/j.cell.2006.04.038


文献链接:

http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.245951.118.

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