Horticulture Research| 辣椒中NDR1/HIN1的全基因组分析及胁迫下CaNHL4的功能表征

西南大学植物保护学院刘昌云等在Horticulture Research 上发表了一篇题为“Genome-wide analysis of NDR1/HIN1-like genes in pepper (Capsicum annuum L.) and functional characterization of CaNHL4 under biotic and abiotic stresses”的研究文献，该文献对辣椒中NDR1/HIN1进行了全基因组分析并对生物和非生物胁迫下CaNHL4的功能表征。

背景：植物NDR1 / HIN1基因在响应生物胁迫并触发植物防御中起着重要作用。从辣椒（Capsicum annuum L.）中鉴定NHL基因和NHL基因在抗病性中的作用的功能表征仍然未知。在这项研究中，我们进行了辣椒中NHL基因的全基因组鉴定，并表征了这些CaNHL基因对非生物胁迫和不同病原体感染的功能作用。

结果：

辣椒中NHL蛋白的系统发育分析

为了确定植物中NHL蛋白之间的进化关系，我们首先从Sol Genomics中检索了NHL蛋白序列。随后使用蛋白序列比对数据构建了系统发育树。这些NHL蛋白可以分为五个不同的组。

图1. 基于NHL蛋白质序列构建系统进化树

鉴定CaNHL蛋白中的调控元件和推定基序

通过TSSP预测这些CaNHL基因的启动子区域，并使用PlantCare中的信息预测启动子区域的调控元件。基于PlantCare的分析显示，CaNHL基因的启动子内分布有26种以上的调控元件。结果表明，NHL蛋白在辣椒中的作用可能与抗病性有关。总体而言，同一基团中的CaNHL蛋白具有保守的基序和相似的蛋白结构域组成，这表明它们在植物发育和抗病性方面具有相似的功能。

图2. CaNHLs的启动子区域的预测调控元件示意图

外源MeSA和MeJA处理下CaNHL的全基因组转录分析

为了确定所有CaNHL基因在不同植物组织中均表达并响应各种胁迫，我们分析了Pepper Informatics Hub数据库中已发布的RNA-seq数据。当辣椒植物受到不同的非生物胁迫的挑战，并经过NaCl，SA，ABA和JA处理时，观察到CaNHL基因的差异表达。这表明其中的一些CaNHL基因参与非生物胁迫反应。进一步研究结果表明，MeSA和MeJA处理可高度激活6个CaNHL基因。

图3. 基于RNA-seq转录组分析显示CaNHL基因差异表达的热图

使辣椒中的CaNHL4沉默会增加对不同病原体的敏感性

以沉默CaNHL4的方式来研究CaNHL4沉默对辣椒对病原体感染的影响，然后同时用辣椒疫霉菌接种沉默的植物和模拟植物，观察到沉默CaNHL4提高辣椒疫霉感染机率。此外，分别通过qPCR和蛋白质印迹法定量了沉默植物和模拟植物的接种和幼叶中TMV：GFP转录物的数量和TRV-GFP蛋白的积累。综合结果表明，沉默CaNHL4显著增强了辣椒对三种病原体感染的敏感性，表明CaNHL4参与了对病原体的防御反应。

图4. 沉默CaNHL4提高了辣椒疫霉菌感染机率

辣椒中CaNHL4的过表达增强了对不同病原体的抗性

为了进一步了解CaNHL4在防御不同病原体中的功能，我们生成了pART27-N-7 :: Myc-CaNHL4表达载体，并通过农杆菌瞬时过表达。结果表明沉默CaNHL4会增加辣椒对这三种病原体的敏感性，但CaNHL4的瞬时过表达会提高辣椒对这三种病原体的抗性，这表明CaNHL4有助于辣椒对不同病原体的抗性。

图5. CaNHL4过表达增强辣椒抗性

CaNHL4定位于质膜

为了探索CaNHL4的亚细胞定位，我们生成了一个CaNHL4：mGFP构建体，该构建体编码与mGFP融合的CaNHL4蛋白。使用共聚焦显微镜观察到绿色荧光信号，并且发现CaNHL4-mGFP定位在质膜中。

图6.亚细胞定位结果

CaNHL4通过介导SA和JA信号通路以及ROS的产生参与辣椒的抗应激防御

为了进一步确定CaNHL4对SA和JA信号传导途径的影响，研究了SA反应基因的表达，发现这些基因在沉默植物中的表达显著下降，表明沉默CaNHL4会破坏这些基因的表达，从而导致SA和JA信号转导通路的失活。我们的结果表明CaNHL4影响SA响应基因和JA响应基因的表达以及ROS的产生，这表明CaNHL4可能通过激活SA和JA信号通路以及ROS的产生参与辣椒的抗应激防御反应。

图7. 沉默CaNHL4会降低SA响应，JA / ET响应和ROS响应基因的表达以及ROS的产生，而CaNHL4的瞬时过表达则产生相反的作用

结论：

研究结果表明，NHL蛋白参与触发对多种生物胁迫的应答，并在诱导植物防御应答中发挥积极作用，功能分析表明，CaNHL参与JA诱导和SA诱导的植物抗逆性，而CaNHL4在辣椒抗逆性中起重要作用。未来将使用诸如CRISPR / Cas9和蛋白质组学技术之类的基因编辑来进一步了解CaNHL4在JA和SA信号通路中的作用。

参考文献：

Martin, G. B., Bogdanove, A. J. & Sessa, G. Understanding the functions of plant disease resistance proteins. Annu. Rev. Plant Biol. 54, 23 (2003).

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Gao, J.-S. et al. The TIR-NBS but not LRR domains of two novel N-like proteins

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DOI: 10.1038/s41438-020-0318-0

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